Перед назначением препарата бактериофага, для решения вопроса о чувствительности к нему возбудителя, необходимо проводить оценку литических свойств фага в лабораторных условиях.
В бактериологических лабораториях проводятся исследования по определению спектра литической активности вирулентных бактериофагов, количества бактериофагов в объектах окружающей среды как санитарно-показательных микроорганизмов, и реже – определение активности (титра) бактериофагов, используемых в качестве лекарственных препаратов, в отношении чувствительных к нему микроорганизмов.
В ходе научных исследований в лабораторных условиях могут быть использованы методы искусственной трансдукции и лизогенизации для подтверждения гипотез о влиянии умеренных бактериофагов на приобретение новых свойств штаммами, в том числе возбудителями ИСМП.
Определение чувствительности микроорганизмов к бактериофагам проводят при необходимости их использования в лечебных и/или профилактических целях.
Определение чувствительности неизвестной культуры к известному бактериофагу может быть использовано в практике работы лаборатории клинической микробиологии для:
- фагодифференцировки – идентификации бактерий по их чувствительности к известному фагу;
- фаготипирования – внутривидового типирования бактерий по их чувствительности к типовым бактериофагам;
По результатам исследования чувствительности микроорганизмов к бактериофагам выдают ответ о наличии или отсутствии чувствительности конкретного микроорганизма, выделенного из биоматериала конкретного пациента, к испытуемому бактериофагу с указанием его производителя, даты выпуска и номера серии.
Изучение спектра литического действия бактериофагов и их активности проводят в лабораторных условиях, соблюдая правила биологической безопасности и требования к организации и проведению данных работ для предотвращения контаминации бактериофагами помещений и оборудования лабораторий.
Литическая инертность вирулентных бактериофагов может быть связана с узким спектром литической активности самого бактериофага или с атипичными свойствами бактериальной культуры.
Требования к организации работы
Противоэпидемический режим работы лаборатории должен быть обеспечен в соответствии с:
- Санитарно-эпидемиологическими правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08;
- Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2518-09 – «Дополнения и изменения N 1 к санитарно-эпидемиологическим правилам «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08;
- Санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» СанПиН 2.1.7.2790-10;
- Руководством Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях».
Требования к проведению работ
- Не допускается проведение работ, связанных с бактериофагами, в помещениях, где осуществляются культуральные работы по накоплению биомассы биологических агентов 3-4 групп патогенности и генно-инженерные работы, в том числе получение и выделение рекомбинантных генетических конструкций.
- Допуск персонала к работе с бактериофагами в лаборатории осуществляется в порядке, регламентированном действующими санитарными правилами проведения работ с микроорганизмами 3-4 групп патогенности.
- По окончанию работы с бактериофагами и микроорганизмами 3-4 групп патогенности все объекты (рабочее место и другие рабочие поверхности) подвергают дезинфекции.
- Лаборатория, проводящая работу с бактериофагами, должна иметь контрольные (эталонные) штаммы микроорганизмов, на которых проверяют активность бактериофагов.
Методические приемы, используемые в микробиологических лабораториях при работе с бактериофагами
Методика определения чувствительности бактерий к бактериофагам (определение спектра литической активности бактериофагов)
Основные этапы проведения тестирования
Оценка чувствительности микроорганизмов к бактериофагам включает последовательное выполнение нескольких этапов лабораторной работы:
- Приготовление питательных сред;
- Приготовление суспензий исследуемых микроорганизмов;
- Посев микроорганизма на питательные среды и последующее нанесение бактериофагов;
- Инкубация;
- Учет и интерпретация результатов, формулировка заключения по чувствительности конкретного микроорганизма к действию конкретного бактериофага.
Питательные среды
Используются стандартные питательные среды. В зависимости от вида бактерии, выбирают питательные среды, на которых исследуемый микроорганизм через минимальное для данного вида время инкубации при оптимальной температуре дает хороший, видимый глазом рост. Питательная среда готовится из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду разливают в стерильные чашки Петри любого диаметра (60 – 90 - 100 мм и др.), в зависимости от объема исследования. Среда разливается в чашки слоем не более 4 мм. Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания и подсушивания для того, чтобы хорошо впитывался фаголизат и испарился конденсат. Неиспользованные чашки с агаром хранят в условиях холодильника при +4 – +8°С. Допускается использование чашек с готовой питательной средой, расфасованных в чашки производителем.
Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов
Необходимым условием для любых методов тестирования микроорганизмов является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма. Для определения чувствительности бактерий к бактериофагам, желательно, чтобы концентрация микроорганизмов в инокуляте составляла 1,5´108 КОЕ/мл, как и при определении чувствительности к АБП. Приготовление инокулята осуществляется в соответствии с МУК 4.12.1890-04. Бактериальную суспензию можно готовить как из бульонной, так и из агаровой культуры.