Раздел IV. Качество, технологии и безопасность пищи

Глава 29. Контроль качества и безопасности пищевых продуктов

29.1. Контроль биобезопасности пищевых продуктов

Задачи микробиологического контроля пищевых продуктов

Санитарно-пищевая микробиология, руководствуясь целью профилактики инфекций от пищи, традиционно имела дело с определением размножившихся до критических уровней условно-патогенных и патогенных бактерий, либо ограниченного круга индикаторов фекального загрязнения [1]. В настоящее время ее задачи значимо расширились и включают в себя:

– контроль качества и безопасности в процессе надзора за пищевой продукцией на всех этапах пищевой цепи;

– производственный контроль и верификация НАССР на предприятиях;

– контроль подлинности продуктов, выработанных с использованием технологических и пробиотических микроорганизмов, в том числе ГММ.

– мониторинг потенциальных возбудителей в пище для оценки микробиологических рисков, анализа микробиологических рисков и управления ими;

– расследование вспышек отравлений и инфекций от пищи и учет их этиологических агентов;

– прогнозную микробиологию (например, для обоснования сроков годности пищевых продуктов).

Пищевые продукты являются трудными объектами для микробиологического анализа — они часто содержат многокомпонентную флору и экранирующих микробов матрицы (жиры, консерванты, полисахариды); в отличие от зараженного возбудителями клинического материала, патогены в них малочисленны или находятся в состоянии стресса из-за воздействия высоких и низких температур, обезвоживания. Все это требует специальных приемов концентрирования и восстановления физиологических свойств микробов. И наоборот, технологическая обработка, ингибируя активность микробов, далеко не всегда разрушает ДНК и другие структуры их клеток, которые могут выявляться в процессе анализа, что также требует интерпретации. Но наиболее значимо влияющим на результативность контроля фактором в последнюю четверть XX в. стало появление новых патогенов, осложняющих дифференциацию болезнетворных бактерий от безвредных из-за сходства их фенотипов с непатогенными представителями своих таксонов.

Ускорение эволюции возбудителей требует постоянного совершенствования порядка и методик контроля, которое должно направляться: на расширение спектра целевых микроорганизмов; повышение чувствительности и скорости их определения в продуктах; адекватный количественный подсчет по ходу производства и в момент потребления; идентификацию принадлежности на уровне рода/вида/фаго- и серотипа; анализ факторов патогенности (токсигенность, инвазивность и др.), наличия и природы резистентности [2].

Нормативная база микробиологического контроля

При надзоре за качеством и безопасностью пищевой продукции лабораторный контроль опирается на нормируемые в технических регламентах ЕАЭС и нормативных документах показатели; при производственном контроле изготовителями их круг может включать также микроорганизмы, представляющие риск перекрестной контаминации на производстве (например, Campylobacter spp. на птицеперерабатывающих предприятиях). Контролируемые группы и виды микроорганизмов представлены в нижеследующей схеме (рис. 29.1).

Рис. 29.1. Основные группы микроорганизмов, контролируемые в пищевых продуктах

В Регламентах ЕАЭС [3–7] установлено более 3 тыс. микробиологических нормативов, что позволяет охватить контролем весь спектр пищевой продукции: от специализированной для питания наиболее уязвимых к инфекции контингентов (дети, больные и пожилые люди, беременные и кормящие и др.) и БАД к пище до массового потребления, включая скоропортящиеся и стабильные в хранении продукты. Разработан порядок и единая методология установления сроков годности продуктов, основой которой является оценка микробиологической стабильности с выявлением и подсчетом микроорганизмов, способных к активизации в процессе хранения, в том числе при аггравированных условиях.

Большинство микробиологических показателей контролируется по массе/объему продукта, в котором не допускается присутствие микроорганизмов тех или иных видов, родов или групп, т.е. размер аналитической единицы адаптирован к величине норматива. Например, если S. aureus не допускается в 0,1 г продукта, то в питательную среду засевается его навеска равной массы или 1 см³ разведения 1:10, содержащий это количество продукта. Для ряда показателей нормируется также количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г (см³) продукта или же показатель выражен только в КОЕ/г (см³). Это относится, например, к количеству мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), содержанию в 1 г (см³) продукта биотехнологических микроорганизмов или возбудителей порчи.

Критериями безопасности консервированных продуктов является отсутствие в них микроорганизмов, способных развиваться при установленной для конкретного вида консервов температуре хранения (промышленная стерильность), и опасных для здоровья человека микроорганизмов и/или их токсинов.

Методическая база отбора проб и приемки партий при микробиологическом контроле. Микробиологический контроль является выборочным. Соответственно, важнейшим условием обеспечения его достоверности и сопоставимости результатов, полученных в разных лабораториях, является стандартизация подходов к отбору проб и размеру репрезентативной выборки, а также к оценке партии пищевой продукции. Благодаря этому нивелируется гетерогенность микробной контаминации в совокупном объеме продукции и учитывается способность микроорганизмов (как контаминантов биологической природы) изменяться в процессе хранения и реализации. Размер выборки зависит от степени потенциальной опасности для здоровья выявляемых микроорганизмов и восприимчивости к инфекции контингента потребителей контролируемого продукта. Так, количество проб для анализа всегда должно быть больше при выявлении патогенов, чем, например, санитарно-показательных микроорганизмов, и при контроле продуктов детского и диетического питания, чем продуктов массового потребления [8].

В нашей стране для большинства видов продукции число проб, отбираемых для микробиологического анализа от представленных к приемке партий, установлено в стандартах, разработанных соответствующими отраслями. Обычно оно варьируется от 1 до 5 выборочных единиц (в транспортной упаковке), из них отбирается лабораторная проба, которая должна быть достаточной для проведения испытаний на все предусмотренные показатели (размером от 250 до 1000 г/см³). Перечень документов, рекомендуемое число выборочных единиц и размер лабораторной пробы для основных видов неконсервированной пищевой продукции представлены в табл. 29.1.

Таблица 29.1. Рекомендуемые нормы отбора проб пищевых продуктов для исследований

Наименование продукта	Документ	Число выборочных единиц от партии	Размер пробы, отбираемой от выборочной единицы
Молочные и молокосодержащие продукты
Сметана и продукты, сквашенные на ее основе; творог, творожные изделия и молокосодержащие продукты на их основе	ГОСТ 26809-2014, ч. 1   ГОСТ 32901-2014	10% в т.у.* 2–6 ед. в п.у.**	2 п.у. массой нетто не менее 250 г или 1 п.у., если более 250 г
Молоко, кисломолочные и сквашенные молокосодержащие продукты жидкие: – в цистернах; – в упаковке		Объединенная проба 5% в т.у. 2–5 единиц в п.у.	1 дм3   1 п.у. 1 п.у.
Мороженое: – в транспортной упаковке; – в потребительской упаковке		5% 10%	2 п.у.
Сухие молочные продукты. Сгущенные молочные продукты		3% в т.у. и в п.у., но не менее 2 ед. 1–6 ед.	2 п.у. или 1 п.у. массой нетто более 1 кг. По 40–50 г от ед.
Масло и паста масляная из коровьего молока, молочный жир, сливочно-растительные спреды, топленые смеси	ГОСТ 26809-2014 ч. 2 ГОСТ 32901-2014	2–5% в т.у. (1–5 ед.) 4–5% п.у.	Необходимое количество ед. массой нетто не менее массы объединенной пробы По 15–20 г от ед.
Сыр, сырная масса, сырный продукт, плавленый сыр и плавленый сырный продукт		1–7 ед. т.у.	1 ед. в форме выпуска (головка, батон, блок или необходимое количество ед. массой нетто не менее массы объединенной пробы)
Мясо- и птицепродукты
Колбасы и колбасные изделия, мясопродукты из мяса и птицы: – изделия массой больше 2 кг любые; – изделия массой менее 2 кг, в том числе без оболочки	ГОСТ 9792-73	10% от объема партии	2 шт. для всех анализов. 2 шт. для баканализа, в том числе 3 шт. для баканализа
Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи	ГОСТ 7702.2.0-95	По НТД на вид продукции	Полуфабрикаты — 150 г. Целая птица — поштучно до 1,5 кг
Рыбопродукты, нерыбные объекты промысла и продукты, вырабатываемые из них
Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Водные млекопитающие, печень рыб, нерыбные объекты. Водные беспозвоночные	ГОСТ 31339-2006	2–20 ед. в т.у. Не более 3% от партии	Из каждой вскрытой ед. т.у. по 2 точечных пробы, составляя объединенную пробу массой нетто не более 3 кг. Из каждой вскрытой ед. т.у. по 3 точечных пробы, составляя объединенную пробу массой нетто не более 2 кг. 1% от сырца, 1,5 кг — от охлажденной и мороженой, 0,5 кг — от сухой продукции
Напитки
Пиво (бутылочное)	ГОСТ 12786-80	Объем партии по ГОСТ 18242 по планам контроля 5 групп	1-я группа — 12–125 бут. 2-я группа — 3–8 бут. 3–5-я группа — 5–13 бут.
Квас – бутилированный; – разливной	ГОСТ 6687.0-86	Объем партии по ГОСТ 18321 по планам контроля 5 групп
Напитки безалкогольные
Кулинарные изделия общественного питания
Продукция смешанного состава (кроме молочной)	ГОСТ 31904-2012	Определяется правилами приемки партии. Отбираются неповрежденные	не менее 1 шт. в п.у., но не более 1000 г (см3)

Примечания. * — транспортная упаковка; ** — потребительская упаковка.

Пробы для микробиологического анализа отбирают асептическим способом, исключающим микробное загрязнение из окружающей среды, до отбора проб для целей любых других испытаний, и транспортируют при температуре, предусмотренной в НТД[1] на конкретную продукцию. Результаты анализа оцениваются по каждой пробе отдельно путем сопоставления с допустимыми уровнями содержания нормируемых микробов, по альтернативной системе двух категорий («пригоден — не пригоден»). При несоответствии по любому из контролируемых показателей по нему допускается анализировать удвоенную выборку и распространять результаты на всю партию. С учетом этого число анализируемых проб от партии может колебаться от 1 до 250.

Российская система отличается от принятой в комиссии «Кодекс Алиментариус» (ККА), где выборка определенного числа образцов для анализа на каждый конкретный показатель производится в соответствии с сэмплинг-планом — схемой, разработанной ICMSF[2] [9]. Согласно минимальному сэмплинг-плану (для продуктов массового потребления с низким риском микробного загрязнения) отбору и анализу подлежит 5 проб от партии, максимальному (для продукции для детей 1 года жизни при контроле патогенов) — 60, при этом используют один или несколько сэмплинг-планов одновременно в зависимости от контролируемых микробов в продукте. Нормируемые категории в них обозначены кодами — «n»; «m»; «М» и «с»[3]. Для приемки партии предусмотрено 2 варианта анализа и оценки результатов:

1) двух категорий («пригодна — не пригодна») — применяется для тестирования патогенов. Здесь с=0, т.е. партия принимается, если во всех проанализированных образцах выборки «n» патогены не обнаруживаются и результат не выходит за пределы «m». «М» не предусматривается;

2) трех категорий («пригодна — пригодна с ограничением — не пригодна») — применяется при подсчете количества или выявлении санитарно-показательных, иногда условно-патогенных микроорганизмов, а также возбудителей порчи. Партия принимается, если все результаты не выше «m» и не принимается, если «М» превышен хотя бы в одном образце из «n». В случае приемки с ограничениями в выборке допускается определенное число проб условно-приемлемого уровня качества со значением показателя, находящегося между «m» и «М». Здесь с >0 (обычно 1–3 при n=5). Этот вариант фактически легализует возможность применения двух значений норматива (<m и от m до M) к продукту в течение срока годности, тогда как в РФ допускается лишь одно.

Следует отметить, что при сформировавшихся рыночных отношениях специалисты в сфере оценки риска признают систему отбора проб и оценки партий ККА инструментом контроля, пригодным (что очень важно) лишь к той продукции, которая вырабатывается и реализуется в условиях полного соответствия предприятий по всей пищевой цепи критериям надлежащей производственной (GMP), гигиенической (GHP) и коммерческой (GCP) практик [2].

В 2013 г. вступил в силу ГОСТ 31904-2012 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний», в котором в том числе рекомендовано применение планов контроля и оценки качества пищевых продуктов по системе трех категорий. Поскольку в нормативной базе РФ и ЕАЭС микробиологические показатели устанавливаются по соответствию одному значению допустимого уровня, подход трех категорий можно реализовать в рамках производственного контроля на предприятиях, на добровольной основе использующих промежуточные корпоративные микробиологические нормы, аналогичные критериям производственной достижимости (Performance Сriterion), принятые у производителей в странах ВТО, для гарантированного обеспечения соответствия требованиям регламентов всего объема производимой продукции [8].

Методические положения ГОСТ 31904-2012 пригодны для любых продуктов смешанного состава, для которых отсутствует НТД на порядок отбора и размер пробы от единицы выборки. Предложенный тут размер лабораторной пробы может быть взят за основу для разработки стандартов на отбор проб пищевой продукции с торговой полки — нового подхода для инспекционного контроля, который не будучи связанным с приемочным контролем зачастую усложняется необходимостью определения размеров выборки, так как прописанные нормы в инструктивных документах в условиях рыночной экономики устарели [10].

Методология контроля. В РФ создана комплексная методическая база микробиологического контроля пищевых продуктов на основе технологий традиционного культурального и современного молекулярного анализа.

В процессе ее создания начиная с середины 1970-х гг. постоянно велась работа по гармонизации методологии контроля с рекомендациями ИСО, унификации процедур определения основных микробных контаминантов пищи с адаптацией к условиям отечественной лабораторной практики. Был установлен единый размер аналитической единицы (25 г) при контроле патогенов; унифицированы методы определения санитарно-показательных микроорганизмов в различных продуктах, в том числе взамен «господствовавшего» почти 100 лет коли-титра внедрен метод определения и подсчета колиформ, параметры которого путем подбора и сопоставления субстратов, температур инкубации, способов учета результатов были максимально сближены с методом ИСО [11, 12]; модифицирован состав питательных сред и предложены отечественные варианты, соответствующие по эффективности прописям ИСО для определения КМАФАнМ, E. coli, S. aureus, Salmonella spp., B. сereus, L. monocytogenes, Campylobacter spp., дрожжей и плесеней [13, 14]; разработаны специальные приемы, повышающие эффективность анализа специализированных продуктов (например, предварительное неселективное обогащение патогенов и некоторых условно-патогенных микроорганизмов в продуктах типа инстант для детей 1-го года жизни) [15]. Гармонизированы общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям пищевых продуктов [16].

В последние годы в условиях активного технического регулирования в аграрно-промыщленном комплексе (АПК) возникла тенденция к прямой имплементации стандартов ИСО на методы микробиологического анализа пищевых продуктов в виде провизорных ГОСТ Р ИСО, межгосударственных ГОСТ ИСО или ГОСТ ЕАСС, в основу которых берутся аутентичные переводы документов ИСО. Это приводит к трудностям с их внедрением в РФ вплоть до отсрочки вступления в силу или продления срока действия заменяемого ГОСТ.

Тем не менее на сегодняшний день все нормируемые показатели обеспечены утвержденными в установленном порядке методиками определения, которые включены в Перечни правил и методов исследований и измерений (в том числе правил отбора образцов, необходимых для исполнения требований ТР ТС и осуществления оценки/подтверждения соответствия продукции), являющиеся неотъемлемыми частями каждого Технического регламента. Так, в Перечень ТР ТС 021/2011 вошло более 50 документов по микробиологическому контролю, в том числе 29 межгосударственных и 9 национальных стандартов, отраслевых инструкций по санитарно-микробиологическому контролю производства различных видов продукции, методических указаний (МУ, МУК) и рекомендаций (МР) Роспотребнадзора. Согласно законодательству о техническом регулировании приоритет при включении в Перечень и осуществлении контроля отдается методам ГОСТ.

Имеется также обширный блок стандартов и МУ на методы анализа микроорганизмов и микробных токсинов, не нормируемых и не подлежащих текущему плановому контролю в пищевых продуктах, но определяемых при расследовании вспышек заболеваний и отравлений, подъема заболеваемости кишечными инфекциями либо в рамках внутренних систем управления качеством, когда это обусловлено спецификой микробных рисков на производстве (Campylobacter spp., Shigella spp., вирусы высокопатогенного гриппа, C. perfringens, C. botulinum, ботулотоксины, Alicyclobacillus spp. и др.).

Культуральные методы. Базовыми методами контроля при оценке соответствия являются методики бактериологического посева, которые нацелены на обнаружение в продуктах жизнеспособных микроорганизмов по признакам их роста или путем выделения/подсчета и изучения чистых культур. В табл. 29.2 приведены сведения о действующих стандартах в сфере контроля основных нормируемых микробиологических показателей в пищевых продуктах (выборка по Перечню ТР ТС 021/2011).

Таблица 29.2. Стандартизованные методы анализа микробиологических показателей в пищевых продуктах

Показатель	ГОСТ	Принцип метода	Гармонизация с ИСО
КМАФАнМ (общее микробное число)	ГОСТ 10444.15-94	Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (бактерий, дрожжей и плесневых грибов) путем глубинного посева в плотные среды или в жидкие среды по НВЧ[4]	–
Колиформные бактерии (бактерии группы кишечных палочек)	ГОСТ 31747-2012	Выявление в массе/объеме продукта посевом в жидкие элективные среды и определение количества по НВЧ или посевом в/на плотные селективно-диагностические среды	ISO 4831:2006 ISO 4832:2006
Бактерии вида Escherichia coli	ГОСТ 30726-2001	Выявление в массе/объеме продукта посевом в жидкие элективные среды с пересевом на селективно-диагностические среды и определение количества по НВЧ и посевом в/на плотные селективно-диагностические среды	–
Презумптивные[5] Escherichia coli	ГОСТ 31708-2012	Выявление в массе/объеме продукта посевом в жидкие элективные среды и определение количества по НВЧ путем культивирования в жидких средах при 37 и 44 °С	ISO 7251:2005
Бактерии рода Salmonella (включая S. typhi и S. paratyphi)	ГОСТ 31659-2012	Выявление в массе/объеме продукта посевом в неселективные жидкие среды с последующим обогащением в селективных жидких средах, пересевом на 2 плотные селективно-диагностические среды и идентификацией изолятов (биохимической и серологической)	ISO 6579:2002
Коагулазоположительные стафилококки и Staphylococcus aureus (S. aureus)	ГОСТ 31746-2012	Выявление в массе/объеме продукта посевом в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и определение количества в/на плотных селективно-диагностических средах и биохимической идентификацией изолятов	ISO 6888-1:1999; ISO 6888-2:1999; ISO 6888-3:2003
Listeria monocytogenes	ГОСТ 32031-2012	Выявление в массе/объеме продукта посевом в жидкие среды с половинной концентрацией селективных добавок при 30 °С, вторичным обогащением в жидких средах с селективными добавками при 37°С, пересевом на 2 плотные селективно-диагностические среды и идентификацией изолятов (морфолого-биохимической, серологической, ПЦР)	ISO 11290-1:1996/Amd.1:2004, NEQ
Презумптивные33 B. cereus	ГОСТ 10444.8-2013	Определение количества посевом на плотные селективно-диагностические среды с идентификацией изолятов (морфолого-биохимической)	ISO 7932:2004
Дрожжи и плесневые грибы	ГОСТ 10444.12-2013	Выявление и подсчет количества дрожжей и плесневых грибов посевом на плотные селективные среды	Де факто ГОСТ ISO 21527-1-2013 и 21527-2-2013
Сульфитредуцирующие клостридии	ГОСТ 29185-2014	Выявление группы бактерий, способных восстанавливать сульфиты, в анаэробных условиях посевом в вязкие среды и определение их количества в плотных питательных средах	ISO 15213:2003

Поскольку юридическим доказательством несоответствия контролируемой пищевой продукции установленным требованиям безопасности является обнаружение живых микробов в превышающих норматив количествах, но не структур их клеток, антигенов, которые могут сохраняться после термической обработки изначально контаминированного сырья, классические культуральные методы микробиологического анализа используются в качестве референс-методов при сравнении результатов контроля продуктов, полученных на основе других подходов [17]. Отсутствие необходимости в сложном аппаратурном оформлении, экономическая доступность, адекватная нормативным уровням чувствительность (вплоть до единичных клеток в грамме продукта при наличии оптимальных условий и достаточного времени для культивирования) обусловливают их широкое применение повсеместно.

Однако длительность получения результата (например, при анализе на Salmonella spp. по классической схеме срок выдачи отрицательного ответа составляет 3 дня, положительного — 6–10 сут) позволяет оценивать продукцию бакпосевом только ретроспективно, к тому же среди микробных контаминантов пищи растет число новых трудно культивируемых и некультурабельных видов. Это диктует необходимость повышения производительности культуральных методов, а также разработки альтернативных молекулярно-биологических методов.

Альтернативные методы в контроле пищевых продуктов. Научные исследования в сфере альтернативных методов микробиологического контроля качества и безопасности пищи бурно прогрессируют в последнее десятилетие [18]. На рынке появились новые приборные технологии и средства для лабораторной диагностики возбудителей бактериальной и вирусной природы, основанные на принципиально разных подходах, пригодные как для специализированных лабораторий, так и для полевого исполнения в местах производства продовольственного сырья и пищевой продукции (табл. 29.3).

Таблица 29.3. Современные методологии в санитарно-пищевой микробиологии

Методология	Сущность
ДНК-анализ	Гибридизация фрагментов генома с зондами; методы амплификации целевых последовательностей микробных ДНК/РНК с праймерами/зондами в присутствии Taq-полимеразы (ПЦР)
Иммуноанализ	Регистрация комплексов «антиген–антитело»
Автоматизированные культуральные методы подсчета	Измерение электрического сопротивления в жидкой среде; утилизация специфических флуоресцирующих субстратов с регистрацией сигнала
Биохимическая идентификация на стрипах или автоматизированная в приборе	Оценка расширенного спектра ферментативных свойств по отношению к углеводам или другим субстратам
ГХ-масс-спектрометрия (MALDI-TOF) и другие метаболические методы (АТФ-метрия, биолюминометрия)	Измерение специфичных метаболитов или структурных элементов прокариот химическими методами при сопоставлении с базами данных
Анализ роста на хромогенных питательных средах	Включение в среду конъюгированных с хромогенным красителем субстратов, специфичных для ферментов целевых бактерий
Прямой подсчет (проточная цитометрия, микроскопия)	Исследование одиночных биологических клеток в потоке с регистрацией сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки

Молекулярно-биологические методы. Основой методов, манипулирующих с НК[6], является гибридизация — специфическое взаимодействие их генетически родственных (комплементарных) цепей. Процедуры ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК гибридизации позволяют выявлять ≥10² микробных клеток в 1 г и сегодня признаются специалистами как наиболее воспроизводимые молекулярные методики [19]. В практику микробиологического контроля в РФ подобная методика впервые была внедрена в 2005 г. для ускоренного (за 24 ч) выявления Salmonella spp. в пищевых продуктах и смывах с оборудования и инвентаря предприятий, а также экспресс-подтверждения принадлежности выделенных культур к Listeria monocytogenes и Salmonella spp. Суть методики — гибридизация участков бактериальной ДНК с закрепленными на твердой фазе (стенке пробирки) флюоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами, специфичными для генов 16S rРНК Salmonella spp. и листериолизина-О L. monocytogenes, с детекцией гибридов по степени их хемилюминесценции в люминометре. Данная методика адаптирована к определению патогенов в нормируемой массе (25 г) продукта с предварительным обогащением в бульоне, применяется и сегодня при контроле мясного сырья [20, 21].

Сегодня наибольшее число практических разработок и публикаций посвящено полимеразной цепной реакции (ПЦР) с разными форматами детекции. В ее основе лежит многократное увеличение (амплификация) ферментом Taq-полимеразой числа копий нуклеотидных фрагментов-мишеней НК, помещенных в смесь из синтетических олигонуклеотидных праймеров/зондов, нуклеозидтрифосфатов и буфера. Совмещение методов амплификации НК (МАНК) целевых микробов с гибридизацией повысило чувствительность ДНК-анализа почти на 2 lg-порядка. При контроле пищи мишенями для ПЦР служат последовательности НК, выделенных из пищевых изолятов, обогащенных культур или непосредственно из продуктов питания. ПЦР протекает циклично на фоне изменений температуры в программируемом приборе (амплификаторе) — на I этапе (денатурация) разрушаются водородные связи в ДНК и получаются отдельные нити. На II этапе (отжиг) к ним присоединяются праймеры — короткие участки ДНК, «садясь» на которые с двух концов ДНК-полимераза осуществляет репликацию нитей ДНК (элонгация) именно того участка, который расположен между двумя праймерами, и только в том случае, если он имеется в исследуемом образце (рис. 29.2). При продолжении циклов нагрева–охлаждения, после каждой новой денатурации число одинарных нитей увеличивается вдвое, и процесс развивается в геометрической прогрессии, приводя на выходе к получению множества копий целевого участка молекулы НК (за 30 циклов образуется 1,5×10⁶ копий 1 мишени) [22].

Рис. 29.2. Схематичное изображение процесса полимеразной цепной реакции

Для дизайна таргетных праймеров при анализе пищевых патогенов чаще всего используют генные детерминанты факторов патогенности, родо- и видоспецифичных 16S и 23S рРНК разделяющего их гипервариабельного интерспейсерного региона (ITS). Так, для выявления сальмонелл и энтерогеморрагических E. coli сегодня сконструировано более чем по 20 строго специфичных нуклеотидных последовательностей, на основе которых выпускается примерно столько же тест-систем [18, 21].

По характеристикам точности (до 98,4%), специфичности (до 99,6%), чувствительности (обеспечивает выявление искомых мишеней ДНК/РНК в аналите в количестве ≥10⁴ геном-эквивалентов КОЕ/г), скорости выполнения (24–48 ч) ПЦР превосходит ДНК-гибридизацию и ИФА. Для жизнеспособных микробов чувствительность может быть повышена предобогащением в накопительных средах, что позволяет выявить искомый патоген даже при очень низком содержании в продукте (менее 1 КОЕ/г).

На рис. 29.3 отражены варианты ПЦР, которые используются и предлагаются для анализа микроорганизмов бактериальной и вирусной природы, присутствующих в пище. Как видно, спектр форматов ПЦР (помимо ПЦР-ЭФ, активно применяемой при контроле ГМО и ГММ и обеспеченной отечественными тест-системами и оборудованием) достаточно широк. Методы ПЦР-ГФл по конечной точке и в реальном времени, ГИФА, nested-ПЦР позволяют на практике проводить высокоспецифичное качественное определение в продукте ДНК/РНК различных микроорганизмов, а также значимо ускорять подтверждение таксономической принадлежности любых выделенных при посеве культур, как патогенных (например, при оценке соответствия по показателю L. monocytogenes в ГОСТ 32031-2012 для их идентификации включены протоколы ПЦР-РВ с использованием импортных тест-наборов BAX System PCR assay for L. monocytogenes, BAX System PCR assay for L. monocytogenes 24E, TaqMan L. monocytogenes Detection Kit и PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent, Foodproof L. monocytogenes Detection Kit, 5’nuclease), так и биотехнологических бактерий.

Рис. 29.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот для контроля микроорганизмов в пище

Кроме того, указанные форматы эффективны при проведении оценки рисков, производственного контроля, договорных закупках сырья из неблагополучных в эпидотношении территорий, для скрининга возбудителей при расследовании вспышек, в том числе обусловленных агентами вирусной природы. Например, в 2009 г. был разработан порядок и провизорная методика лабораторного контроля загрязненности мясопродуктов вирусом гриппа типа А, в том числе высокопатогенного субтипа А/H1N1, которая на этапе дополнительного комплексного контроля образцов предусматривала типирование вируса методом ОТ-ПЦР, когда перед обычной ПЦР с помощью ревертазы вирусная РНК переводится в формат ДНК с получением одноцепочечной кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР [23].

Принцип гнездовой ПЦР заключается в последовательном использовании двух пар праймеров (внешней и внутренней) и проведении двух последовательных реакций с целью уменьшения накопления побочных продуктов и повышения чувствительности (до 1 копии геном-эквивалента), особенно при работе с продуктами, которые содержат ингибирующие ПЦР-факторы (например, мягкие сыры) [21]. В РФ nested-ПЦР применяют в основном в научных исследованияx [24].

Способ амплификации НК в ГИФА позволяет выявлять большое число различных антигенов одновременно, поскольку после связывания антигенов с антителами последние легко могут быть идентифицированы по уникальным присоединенным к ним олигонуклеотидным последовательностям. За рубежом выпускают тест-системы для ГИФА-определения видового спектра возбудителей порчи пива и бродильных производств из рода Lactobacillus и установления среди них доминантных представителей.

Формат ПЦР-РВ основан на гибридизации меченых олигонуклеотидных зондов, введенных в состав реакционной смеси, с комплементарным участком ДНК-мишени, при которой по мере накопления ампликонов происходит нарастание сигнала используемой метки, чаще всего флуоресцентной. Измерение интенсивности сигнала в присутствии ВКО[7] позволяет регистрировать уровень специфического продукта амплификации и точно измерять его количество непосредственно по ходу реакции (в реальном времени) и по ее завершению (в конечной точке). Взамен флуоресцентных ДНК-зондов можно использовать флуоресцентные интеркалирующие красители, например, Sybr Green I, который связывается с двухцепочечной ДНК, обеспечивая упрощенный, но экономичный вариант детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в режиме ПЦР-РВ. Количественный метод ПЦР-РВ имеет много преимуществ, позволяя оценивать уровни экспрессии генов-мишеней, но главное — давать ответ о жизнеспособности целевых микробов при подборе определенного формата пробоподготовки [25]. Кроме того, поскольку реакция проходит в одной пробирке, здесь исключается контаминация проб продуктами амплификации и постановку ПЦР-РВ можно осуществлять в любой лаборатории, оснащенной соответствующим оборудованием.

При мультиплексной ПЦР в реакции используется несколько пар праймеров для одновременной амплификации нескольких детерминант в одной пробирке. Хотя подбор условий для оптимальной работы всех праймеров, входящих в реакцию, сложная задача, но при ее решении в сочетании с ПЦР-РВ эффективность и экономическая оправданность исследования наиболее высоки и признаются самыми перспективными направлениями в деле микробиологического контроля качества и безопасности пищи [26].

Биочип-технологии (microarrays) основаны на гибридизации неизвестных молекул вещества с известными (зондами), иммобилизованными на плотной поверхности, в геле, на кварцевых шариках в определенном порядке, дискретно в виде микроскопических точек (размером менее 100 мк каждая). В зависимости от основы зондов и задач анализа есть нуклеотидные, тканевые, белковые чипы, в том числе иммуночипы (на основе антител). Гибридизацию в зонах расположения молекул, гомологичных искомым мишеням, учитывают в соединенных с компьютером автоматических чип-детекторах, сканируя интенсивность сигнала различными методами (чаще всего флюоресцентным).

Основными преимуществами чипов для контроля пищи является быстрота анализа (2–6 ч) и возможность одновременной детекции таксономически неродственных микробов (бактерий, вирусов, грибов), детерминант их патогенности, антибиотикоустойчивости, что позволяет идентифицировать и сразу оценивать их патогенный потенциал. Так, для своевременного выявления возбудителей инфекций в продуктах организаторы ЧМ-2014 по футболу в Бразилии использовали систему VerePLEX Biosystems, воспроизводящую на одном чипе гибридизационный анализ, совмещенный с мульти-ПЦР, для 17 агентов Salmonella spp., Shigella spp., Listeria spp., Cronobacter sakazakii, B. cereus, C. perfringens, E. coli, вероцитотоксигенных E. coli, Campylobacter jejuni/coli/lari, S. aureus, V. cholerae&parahaemolyticus, норовирусов геногрупп I и II, ротавирусов А, В, С, а также вирусов гриппа.

Проблемы внедрения ПЦР-методов. Наряду с преимуществами у всех форматов ПЦР есть и слабые стороны. Так, из-за очень высокой чувствительности ПЦР попадание в опытную пробирку даже следовых количеств целевой НК (из других испытуемых образцов, ампликонов от предыдущей амплификации) на этапе пробоподготовки и внесения реакционной смеси приводит к ложноположительным реакциям. И наоборот, недоочистка экстракта НК от ингибиторов (например, полисахаридов) ведет к подавлению ПЦР и негативному результату даже при наличии в пробе НК-мишени. Кроме того, при контроле пищи выявление бактерий по фрагментам ДНК — еще не свидетельство их жизнеспособности, поэтому для подтверждения аналит для ПЦР всегда параллельно засевали в питательные среды, что низводило экспрессность реакции к нулю.

Большую часть этих проблем позволяет преодолеть использование ПЦР-РВ, но при условии специального протокола пробоподготовки и адаптации процедуры экстракции НК из исходной пробы к величине норматива.

В целом ДНК-методы в РФ внедряются в практику микробиологического контроля менее интенсивно, чем за рубежом. Основными причинами этого являются высокая стоимость детекторов и соответствующих компьютерных программ, низкая стандартизация процедур, недостаток отечественных тест-систем (практически все производимые в РФ предназначаются для диагностики инфекций и не адаптированы для анализа пищевых продуктов). Имеющиеся в приборной базе отечественных пищевых лабораторий амплификаторы, как правило, задействуются для анализа ГМО, но из-за специфики требований к безопасности работ с патогенами совместно с бактериологами не эксплуатируются. Поэтому вопросы оснащения баклабораторий оборудованием для ПЦР требуют ускорения.

Из расходных материалов сегодня доступны импортные наборы реагентов для качественного ПЦР-РВ выявления и видовой идентификации в пищевых продуктах 17 видов патогенных и условно-патогенных бактерий (марки SureFast^®[8], предел детекции: ≤5 копий ДНК, 1 КОЕ после обогащения), в напитках, вине и пиве — 6 видов возбудителей порчи (марки GEN-IAL^® с зондами GEN-IAL^®, TaqMan™), для мультиплексного выявления без предварительного обогащения 30 видов и идентификации 19 видов бактерий, вызывающих порчу пива. Наборы указанных марок, однако, адаптированы к конкретным амплификаторам, а наборы для выявления вирусов (норовирусы геногруппы I и II, гепатита А, гриппа) пригодны только для анализа проб воды [28].

Есть и отечественные наборы серии АмплиСенс^® для ускоренного выявления родов Salmonella, Shigella, вида Cronobacter sakazakii, энтерогеморрагических Escherichia coli, Campylobacter spp. видов C. jejuni, C. coli, C. lari, L. monocytogenes в массе (объеме) пищевого продукта методом ПЦР-РВ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (с предварительным подращиванием), а также идентификации изолированных культур (особенно в случаях затруднений взамен расширенного набора фенотипических тестов). Преимуществом этих наборов является то, что они адаптированы к большинству современных амплификаторов, валидированы в соответствии с установленным в РФ порядком, а при положительном результате не требуют подтверждения жизнеспособности патогенов [29].

Иммуноанализ. В микробиологическом контроле находит применение целый ряд иммунологических методов, основанных на выявлении структурных компонентов или метаболитов микробных контаминантов пищи, обладающих антигенностью, в разных вариантах реакции «антиген–антитело». Среди них иммуноферментные, иммунохроматографические, агглютинационные, оптико-иммунные, иммуномагнитные методики, быстро (от 20 мин до 6 ч) воспроизводимые и в приборном, и в портативном форматах.

ИФА и его разновидность — фермент-зависимый флюоресцентный анализ выполняются на твердой матрице (микротитровальные пластины, полистироловые планшеты и стрипы, пипетирующие наконечники), сенсибилизированной высокоспецифичными моно- или поликлональными антителами к антигенам-мишеням, соединенными с ферментами пероксидазой, щелочной фосфатазой и др. Добавление в систему субстрата, в том числе с флюоресцентной меткой, и последующее измерение сигнала от продукта ферментативной реакции (визуально, колориметрически, фотометрически, по флуоресценции) позволяет интерпретировать результат как качественный или количественный по отношению к контрольным тестовым значениям. Имеются прямые и непрямые (основанные на конкурентном взаимодействии антител с конъюгатом из антивидовых антител либо комплексов стрептавидин-биотин, так называемый «сэндвич») форматы, причем последние, вынося активную группу на большее расстояние от мишени, снижают риск неспецифичности; в качестве антигенов выступают соматические, капсульные, флагеллярные белки микробов, фрагменты их клеточных стенок или мембран, гаптены токсинов, соединенные с носителями.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) основан на принципе тонкослойной хроматографии. Он включает реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом в пробе на специальных пластиковых подложках с наклеенными мембранами (адсорбирующими и рабочей). На аналит-адсорбирующем конце расположена мембрана с маркером из конъюгата специфических антител на коллоидном золоте, латексе или других частицах. В середине рабочей мембраны — отдельные аналитическая и контрольная зоны, на первой иммобилизован антиген (либо гаптен с носителем), во второй — антитела-мишени. Нанесенный на полоску жидкий аналит, двигаясь под действием капиллярных сил, смывает конъюгат. Продвигаясь дальше, тот достигает зону иммобилизации антигена, связывается с ним и дает окрашенную линию. Если в пробе есть антиген, то он реагирует с антителами до достижения аналитической зоны, и линия не образуется (рис. 29.4) [30].

Рис. 29.4. Схема иммунохроматографического анализа [30]

Варианты ИХА (зависящие от маркеров, типов взаимодействия — прямые, непрямые) активно внедряются в ИХ-тесты для определения возбудителей туляремии и других опасных инфекций, контроля антибиотиков, микотоксинов в пищевых продуктах, обеспечивая высокие пределы обнаружения.

В оптико-иммунных системах (оптических сенсорах) молекулы антител (например, к вирусу гриппа А) наносятся на поверхность кремниевого чипа, при связывании с антигеном пробы происходит изменение толщины молекулярного слоя на уровне долей нм, которое учитывается визуально как изменение цвета сенсорной поверхности.

Наиболее давно известны агглютинационные серологические тесты, используемые на заключительном этапе классических посевов на энтеробактерии для идентификации изолятов в РА на стекле, а также для анализа возбудителей пищевых токсикоинфекций в биоматериалах путем РПГА, РГА, РНГА. Имеются их ускоренные разновидности с адсорбцией антигенов либо антител на ультрадисперсных частицах неорганической (Fe₂O₃) и органической природы (латекс), например, обратная пассивная латексная агглютинация (РОПЛА) [22]. Появление эффективных сорбирующих антигены материалов и синтетических специфических О-антигенов позволило применить эффект агглютинации непосредственно в среде обогащения при посевах пищевых продуктов и смывов без выделения чистой культуры. Метод обеспечен высокоспецифичными готовыми тест-системами (Locate^®Spectate, Locate^®Salmonella, Locate^®Listeria), занимая всего несколько минут, может ускорять традиционный бакпосев и кондуктометрический анализ, но требует эффективного подращивания бактерий минимумдо 10⁷ КОЕ/см³ бульона.

Использование магнитных частиц в качестве твердой фазы обеспечило ряд преимуществ для иммуномагнитных методик: например, большая сорбционная поверхность наночастиц резко повышает иммуноконцентрацию антигенов или антител и уменьшает время диффузионных процессов, простота разделения реакционной смеси с помощью магнита дает четкость в интерпретации результата и полноту извлечения мишеней. В пищевой микробиологии они находят применение не только в качестве диагностических тестов, но и все чаще как средства пулирования единичных клеток патогенов из экранирующих их матриц (шоколад, жировые продукты) на этапе обогащения в жидких средах, особенно перед тестированием в ПЦР [31].

Разработан большой массив коммерческих тест-систем и считывающих приборов для ИФА патогенов в пище, в том числе предлагаемых на отечественном рынке. Это серия продуктов французской фирмы bioMerieux для воспроизведения в автоматическом иммуноферментном анализаторе VIDAS или miniVIDAS bioMerieux^®: наборы VIDAS-SLM, VIDAS^® Campylobacter (CAM), Vidas: Vidas: Salmonella, L. monocytogenes Xpress, Vidas: Listeria monocytogenes II, Vidas: Listeria Duo, Vidas: E. coli O157, а также совместимые со спектрофотометрами любого типа ИФА тест-системы RIDASCREEN^® ELISA немецкой фирмы R-Biopharm AG: для выявления бактерий родов листерия, сальмонелла, кампилобактер — RIDASCREEN^®Listeria, RIDASCREEN^®Salmonella[9], RIDASCREEN^®Campylobacter, а также энтерогеморрагических E. coli — RIDASCREEN^®Verotoxin (путем непрямой ИФА по шигаподобным токсинам I и II). Однако как в ПЦР, так и в иммунометодах коммерческие компании заинтересованы в разработке тест-систем лишь для нормируемых патогенов, в связи с чем круг их использования при контроле ограничен.

Недостатки — по большей части такие же, как и в ПЦР. Так, декларируемая чувствительность всех известных методов индикации антигенов бактерий равна содержанию 10^{5 и} более их КОЕ в 1 мл аналита, а на деле составляет 10⁶–10⁷. Поэтому все они нуждаются в обязательном предварительном обогащении образцов для накопления искомых культур до детектируемого уровня, а часто и в подтверждении их жизнеспособности бакпосевом. При использовании диагностикумов, созданных на основе гипериммунных сывороток животных-продуцентов, не исключается и возможность перекрестных реакций (за счет общих антигенных детерминант у близкородственных бактерий, например, из семейства кишечных). Этот недостаток стал уменьшаться с развитием гибридомных технологий получения моноклональных иммуноглобулинов, но до конца не исчерпан.

Другой проблемой является ограниченность иммунометодов кругом таксонов (вид, серовар/серотип), для которых создавалась иммунная сыворотка. Например, тест-системы для выявления бактерий рода сальмонелл не могут охватить все серотиповое разнообразие Salmonella spp., выявляя наиболее часто циркулирующие. Плюс из-за разной антигенной активности отдельных компонентов полиантигена соответствующие им антитела могут накапливаться неравномерно, и затем одни из них могут выявляться в большей степени, другие — в меньшей, и нельзя ожидать выявления всех в одинаковой степени. Преодолеть это в состоянии биочипы на основе антител к определенному набору структурных элементов микробных клеток. В клинической микробиологии ожидается преобразование серологических методов в мультипараметрические системы, повышающие эффективность диагностического поиска. Однако ни те, ни другие пока не созданы.

С учетом данных аспектов признается, что иммунометоды могут служить средствами скрининга эпидзначимых и индикаторных агентов определенного рода, группы, вида или серотипа при микробиологическом контроле пищи и санитарного состояния объектов по ее производству, а также высокоспецифичными способами промежуточной идентификации выделенных культур [например, в ГОСТ 32031-2012 они допущены в виде валидированных и сертифицированных тестов и тест-систем для родовой идентификации Listeria spp. — Listeria Latex Kit, Singlepath Listeria, VIDAS Listeria Duo (LDUO), для видовой L. monocytogenes — VIDAS Listeria monocytogenes ll (LMO2), Singlepath L’mono, но не должны использоваться для окончательного анализа продукции при оценке ее соответствия] [22].

Безусловной нишей иммунометодов является анализ токсинов микробной природы в силу его высокой специфичности и удовлетворяющей целям контроля чувствительности как в порядке надзора за безопасностью пищи (СЭТ[10] нормируется в сырах и сырных продуктах, сухих продуктах для детского и лечебного питания на молочной основе), так и при расследовании отравлений. В РФ зарегистрированы методики детекции СЭТ в подготовленных соответствующим образом пробах продуктов путем непрямого твердофазного ИФА и фермент-связанного флуоресцентного иммуноанализа, позволяющие обнаруживать эпидзначимые типы СЭТ А или СЭТ В при раздельном определении, а также энтеротоксины типов А, В, С (C₁, C₂, C₃), D и E при совместном дифференцированном и недифференцированном определении. Для этих целей аттестованы тест-системы «VIDAS^®Staph enterotoxin II (SET2)», RIDASCREEN®SET A, B, C, D, E, RIDASCREEN^Ò SET Total с пределом детекции от 0,00025 до 0,001 мг/кг. Протоколы экстракции СЭТ адаптированы к пробам молока, кисломолочных продуктов, сухого молока, сыров, мяса и мясопродуктов, готовых мясных изделий, морепродуктов, концентратов готовых блюд, сублимированных и других дегидратированных пищевых концентратов [32].

Ведутся активные разработки ИХА для определения микотоксинов, в которых авторам удалось достичь пределов детекции для афлатоксина B₁ 0,00000002 мг/кг аналита, охратоксина A 0,0000001 мг/кг, зеараленона 0,00000025 мг/кг, что в среднем на 3 порядка ниже установленных нормативных значений в пищевых продуктах [33].

В то же время определение токсинов C. botulinum и B. cereus в пищевых продуктах до сих пор проводится путем биологических проб. Так, ботулотоксины выявляют в реакции нейтрализации (РН) при введении экстракта подозрительного продукта в смеси с антитоксическими сыворотками белым мышам, регистрируя у них клинические симптомы или гибель, характерные для ботулизма. С помощью РН в растворе или экстракте можно обнаружить 10 пг/мл нейротоксина (0,00001 мг/кг). Несмотря на высокую разрешающую способность, РН на практике неудобна (ответ выдается лишь через 72–96 ч; ботулотоксин невозможно обнаружить в образцах, вызывающих гибель мышей от других токсичных продуктов). Этих недостатков лишены твердофазный ИФА, РИГА, позволяющие получить результат за 2–4 ч, даже если ботулотоксины находятся в исследуемом материале в смеси с другими ядовитыми веществами. Однако их чувствительность по сравнению с РН ниже на 3 порядка, что обусловливает крайнюю важность разработки новых подходов к иммуноанализу при ботулизме.

Альтернативные методы, основанные на культуральном анализе

Данные методы активно развиваются в следующих направлениях:

– создание хромогенных питательных сред с индикаторами биохимических реакций. Так, на принципе хромогенности основаны получившие широкое распространение в лабораториях пищевых предприятий плотные среды на подложках (Петрифильмы, Рида-каунт и др.), на помещаемых в прозрачные емкости лопастях (НоваСтрик). Особое внимание сегодня уделяется средам нового поколения, содержащим комплексы флюорохромных красителей (например, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида) с субстратами для ферментов, экспрессируемых бактериями определенных видов и даже серотипов. Их использование значимо повышает селективность и ускоряет анализ уже на этапе выделения (например, SMAC-агар для сорбит^(-) энтерогеморрагических E. coli серотипа О157:H7), что особенно ценно для выявления эмерджентных патогенов среди фенотипически подобных непатогенных представителей [26, 34];

– приборная автоматизация определения количества микроорганизмов. В основу предложенных приборов заложены разные подходы. Анализатор ТЕМПО, работающий на основе данного подхода, позволяет определять НВЧ КМАФАнМ, БГКП, E. coli, Enterobacteriacea, S. aureus, дрожжей и плесеней [35]. Измерение электрического сопротивления (импеданса) питательных сред в процессе роста микробов используется в кондуктометрических приборах БакТрак серии 4000, Рэббит, Мальтус, АТВ для определения присутствия и подсчета количества всех нормируемых микроорганизмов в продуктах, а также экспресс-анализа чувствительности изолятов к антибиотикам и определения МИК[11]. Данный метод признан в качестве официального в РФ [36], США (АОАС USA 991.38.), Германии, Австрии, Франции.

Преимуществом культуральных альтернативных методов подсчета, в том числе на хромогенных средах, является то, что детектируются только живые микробы, пережившие технологический процесс переработки, и нет гипердиагностики за счет выявления нежизнеспособных клеток или структур.

– ускорение заключительного этапа культурального анализа — идентификации выделенных из пищи микроорганизмов. Наряду с описанными выше серологическими и генетическими тестами, предложено множество методик, основанных на определении биохимического профиля культур. Наиболее доступными среди них являются ручные диагностические тест-панели, в лунки которых внесено от 10 до 64 лиофилизированные субстратов. При добавлении микробных суспензий субстраты растворяются, и в ходе инкубации происходят реакции, результаты которых регистрируются по изменению цвета индикаторов или при добавлении реактивов, визуально или автоматически. Полученный фенотипический профиль регистрируют и сравнивают с соответствующей базой данных. Интерпретация результатов весьма облегчается при помощи соответствующих тест-систем компьютерных программ [37].

В лабораториях с большим потоком образцов для идентификации культур используют автоматические микробиологические анализаторы, работающие по тому же принципу. Например, VITEK-2 Compact (bioMerieux, Франция), включенный в МР 02.032-08 «Идентификация микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам с применением автоматического микробиологического анализатора VITEK-2 Compact», утвержден в системе Роспотребнадзора. Другим зарегистрированным прибором для экспрессной идентификации и определения чувствительности культур к антибиотикам является МикроТакс (Sy-Lab, Австрия). Вместе с тем биохимическое тестирование не всегда может обеспечить однозначную идентификацию микроорганизмов на уровне вида, подвида, серотипа и не пригодно для арбитражных ситуаций.

Развитие этого раздела контроля происходит за счет внедрения технологий протеомики, например, матричной лазерной десорбционной ионизации в комплексе с времяпролетной масс-спектрометрией (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass-Spectrometry — MALDI-TOF MS). Процесс предусматривает перевод молекул нуклеиновых кислот, полипептидов и белков микроба в ионизированную форму с последующим измерением количества образующихся положительных или отрицательных ионов. Метод позволяет проводить прямой MS-анализ белковой фракции микробной клетки (белковое профилирование) без фракционирования и очистки отдельных белков, сразу при появлении роста на любой плотной или жидкой среде и в течение от нескольких минут до 1,5 ч обнаруживать искомые объекты в ассоциациях микробов. Идентификация производится сопоставлением полученных масс-спектров с данными постоянно пополняющейся базы в системе MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Германия), содержащей белковые профили для 4 тыс. штаммов (2 тыс. видов) микроорганизмов. Одновременно можно анализировать 96 проб на панели. Сочетание MS с секвенированием позволяет также определять мутации в генах, отвечающих за резистентность и другие свойства исследуемых микробов [по 19].

Оборудование для MALDI-TOF MS уже активно используется в клинике для диагностики инфекций, получен опыт его применения для расшифровки вспышек пищевых токсикоинфекций и ботулизма. Методика выгодна и тем, что требует минимум расходных материалов (преимущественно стоимость одноразовых наконечников и пробирок).

Валидация альтернативных методов анализа. Основным условием применения любых альтернативных методов анализа для оценки соответствия продуктов установленным регламентам является их валидация, т.е. доказательство соответствия характеристик нового метода референс-методу. В РФ принят ГОСТ Р ИСО 16140-2008 «Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов», алгоритм которого включает стандартизацию метрологических характеристик (чувствительность, специфичность), сравнительные исследования методики с референс-методом при экспериментальной и естественной контаминации продуктов микроорганизмами, а также межлабораторные испытания.

В ходе стандартизации должна быть отработана процедура пробоподготовки для каждого конкретного вида продукта с адаптацией размеров исследуемых проб установленным нормативам. Чаще всего для доведения культур в образцах до детектируемого уровня используется подращивание в жидких средах, перспективны процедуры концентрации физическими (центрифугирование, коагуляция, фильтрация, сонификация), химическими (адсорбция на твердых поверхностях, биопленках, сорбция на колонках), биологическими (иммуноаффинные, иммуномагнитные), комбинированными (пулирование до 10 образцов одновременно, например, в системе «Пататрикс») методами.

Валидированная методика должна быть утверждена компетентным органом.

Заключение. На современном этапе очевидно, что микробиологический контроль качества и безопасности пищи в РФ должен развиваться в рамках риск-ориентированного подхода к объектам производства и основываться на таких принципах, как:

– охват контролем всей цепи производства [ферма/убой (хозяйство/сбор урожая)/переработка/хранение/реализация готовой продукции] и обеспечение целостности прослеживаемости информации о результатах;

– акцент на первичном звене производства для раннего выявления патогенов и принятия адекватных подходов при переработке;

– использование экспресс-анализа патогенов/токсинов в точке потребления, разработка и внедрение экспресс-методов комплексного выявления патогенов различной природы в продукции, стандартизация метрологических характеристик и методов и прекращение практики официализации их перечней для оценки соответствия;

– интеграция новых методических технологий и полифазных подходов в референс-методы, усовершенствование методов анализа подлинности технологических и пробиотических микроорганизмов в пищевой продукции, в том числе методов, основанных на полногеномном секвенировании для ГММ;

– учреждение системы микробиологического мониторинга патогенов и антибиотикорезистентных микроорганизмов в пищевой цепи для целей оценки микробиологического риска.

В перспективе с упрочением позиций рыночной экономики и исходя из целей дальнейшая гармонизации российских нормативов на пищевую продукцию с международными стандартами необходимо рассматривать внедрение принципов микробиологического нормирования по трехвариантной оценке партий по системе ICMSF. В качестве первого этапа — пересмотр установленных в отраслях норм выборки и порядка отбора проб для микробиологических исследований в соответствии с сэмплинг-планами, принятыми в ВТО.

Литература

1. Санитарная микробиология / под ред. Г.П. Калины, Г.Н. Чистовича. М.: Медицина, 1969. 384 с.
2. Шевелева С.А., Куваева И.Б. Гармонизация требований к микробиологической безопасности пищевых продуктов: постановка вопроса и современные проблемы // Вопр. питания. 2006. № 4. С. 35–45.
3. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021 «О безопасности пищевой продукции».
4. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 033 «О безопасности молока и молочной продукции».
5. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 034 «О безопасности мяса и мясной продукции».
6. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 027/2012 «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания».
7. ТР ТС 023/2011 «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей».
8. Шевелева С.А. Анализ микробиологического риска как основа для совершенствования системы оценки безопасности и контроля пищевых продуктов: дис. … д-ра мед. наук. М., 2007. 326 с.
9. Общее руководство по выборочному контролю (CAC/GL 50-2004).
10. ГОСТ Р «Молоко и молочная продукция. Методика отбора проб с торговой полки, доставки в лабораторию и правила испытаний» (проект). М.: ФГБНУ «ВНИМИ», 2017.
11. Куваева И.Б. Микроэкологические проблемы питания // Вестн. АМН СССР. 1986. № 11. С. 54–60.
12. Шевелева С.А. Обоснование унифицированных параметров контроля пищевых продуктов на бактерии группы кишечных палочек // Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения окружающей среды 6 сборник. Ч. 2. М., 1988. С. 118–119.
13. Петрушина Л.И., Колосницына Н.В., Шевелева С.А. Моделирование формулы среды типа Байрд-Паркер на основе отечественных ингредиентов для выявления S. aureus // Вопр. питания. 1988. № 5. С. 60–65.
14. Шурышева Ж.Н., Шевелева С.А. Методические подходы к изучению распространенности и количественного содержания бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах // Вопр. питания. 2006. № 6. С. 44–50.
15. Методические указания «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов». Минздрав России 4.2.577-96.
16. ГОСТ ISO 7218-2015 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».
17. ГОСТ ISO 16140-2011 «Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов».
18. Ефимочкина Н.Р. Микробиология пищевых продуктов и современные методы детекции патогенов. М.: Изд-во РАМН, 2013. 518 с.
19. Глушанова Н.А., Блинов А.И. Инновационные технологии в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний: учебное пособие для врачей-бактериологов. Новокузнецк: ГБОУ ДПО «Новокузнецкий институт усовершенствования врачей», 2011. 27 с.
20. МУК 4.2.1955-05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и L.monocytogеnes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа».
21. Stevens K.A. The role of molecular methods in the detection of pathogens in food. A dissertation submitted for degree of Ph.D. USA: North Carolina State University, 2004. 157 р.
22. Swaminathan B., Feng P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1994. Vol.48. P. 401–426.
23. Методические указания МУК 4.2.2517-09 «Лабораторный контроль за загрязненностью мясопродуктов вирусом гриппа типа А».
24. Биологические свойства лактобацилл. Перспективы использования в лабораториях Роспотребнадзора экспресс-методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) при контроле качества пищевых продуктов, БАД к пище, лекарственных форм, содержащих лактобациллы: аналитический обзор. Н. Новгород: ФБУН ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, 2011. 41 с.
25. Булахов А.В. ПЦР-диагностика контаминации пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter и кампилобактериоза у людей: дис. … канд. биол. наук. М., 2012. 137 с.
26. Костенко Ю.Г. Руководство по санитарно-микробиологическим основам и предупреждению рисков при производстве и хранении мясной продукции. М.: Техносфера, 2015. 640 с.
27. Cabibbe A.M., Miotto P., Moure R., Alcaide F. et al. Lab-on-chip-based platform for fast molecular diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 2015. Vol. 53, № 12. P. 3876–3880.
28. URL: http://www.stylab.ru/directory/microbiology/
29. МУК 4.2.2872–11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».
30. Urusov A.E., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Use of gold nanoparticle-labeled secondary antibodies to improve the sensitivity of an immunochromatographic assay for aflatoxin B1 // Microchim. Acta. 2014. Vol. 181, N15–16. P. 1939–1946.
31. Urusov A.E., Petrakova A.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. «Multistage in one touch» design with a universal labelling conjugate for high-sensitive lateral flow immunoassays // Biosens. Bioelectron. 2016. Vol.86. P. 575–579.
32. МУК 4.2.2879-11. Методические указания «Дополнения и изменения №1 к методическим указаниям МУК 4.2.2429-08 “Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах”».
33. Urusov A.E., Zherdev A.V., Petrakova A.V., Sadykhov E.G. et al. Rapid multiple immunoenzyme assay of mycotoxins // Toxins. 2015. Vol. 7, N2. P. 238–254.
34. Методические указания МУК 4.2.2884-11 «Методы микробиологического контроля объектов окружающей среды и пищевых продуктов с использованием петрифильмов» М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. 24 с.
35. Методические указания МУК 4.2.3261-15 «Определение количества микроорганизмов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом наиболее вероятного числа с применением автоматического экспресс-анализатора» (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека — Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 21.05.2015).
36. Методические указания МУК 4.2.2578-10 «Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 19.02.2010).
37. Шевелева С.А., Быкова И.Б., Черкашин А.В. Усовершенствование лабораторного контроля технологических микроорганизмов // Переработка молока. 2013. № 3 (159). С. 12–17.